ibex 60-1003-001說(shuō)明書

PROCOLLAGEN II C-PROPEPTIDE ELISA ITEM #60-1003-001 (CP II ELISA)

前膠原ⅡC-丙肽酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

1.1程序原則
本試驗(yàn)測(cè)量新合成的前膠原釋放到基質(zhì)中后從II型前膠原中裂解的II型膠原羧基丙肽（C-丙肽，本文也稱為CP II）。
本試驗(yàn)僅用于體外研究，已優(yōu)化用于分析人血清，但也用于分析各種類型的樣品和物種。它僅用于比較分析，不用于診斷目的。所有樣品必須以推薦的方式進(jìn)行處理。
1.2分析原理
本試驗(yàn)是一種96孔競(jìng)爭(zhēng)性免疫試驗(yàn)，利用預(yù)先包被在ELISA板上的牛CP-II抗原。將牛CP II標(biāo)準(zhǔn)和未知樣品添加到聚丙烯混合板中，然后用兔多克隆抗血清特異于CP II。將該混合物預(yù)孵育以允許抗體與游離CP-II抗原結(jié)合。然后將預(yù)孵育的樣品從聚丙烯混合板轉(zhuǎn)移到CP II ELISA板上，并孵育以使抗體結(jié)合到固定在板上的CPII、CP II標(biāo)準(zhǔn)或血清樣品中的內(nèi)源性表位。洗滌后的CPII酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)板，加入共軛山羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶（GARHRP），它結(jié)合在板上的任何兔抗體。再次清洗CPII-ELISA板后，
將四甲基聯(lián)苯胺底物（TMB）加入到與HRP反應(yīng)生成藍(lán)色產(chǎn)物的各孔中。
停止反應(yīng)并用酸放大信號(hào)，酸將產(chǎn)物從藍(lán)色轉(zhuǎn)化為黃色，可在450 nm處定量。450nm處的光密度（OD）與
與樣品中新表位的數(shù)量成正比。1.3背景
透明軟骨是由一個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)，主要含有II型膠原原纖維和一個(gè)大的聚集蛋白聚糖稱為聚集蛋白聚糖。關(guān)節(jié)炎時(shí)，膠原基質(zhì)破壞，蛋白多糖含量降低。
基質(zhì)成分的這種變化涉及基質(zhì)膠原過(guò)度降解和通過(guò)提取CPII揭示的膠原合成的變化（Squires等人2003年；Aurich等人。2005年）。
II型膠原是一種前膠原，含有氨基和羧基丙烯肽。當(dāng)膠原與膠原原纖維結(jié)合時(shí)，這些被氨基和羧基蛋白酶從細(xì)胞外去除。丙肽的半衰期約為18小時(shí)（Nelson等人。。CP II含量與II型膠原合成直接相關(guān)（Nelson等人。1998年）。
膝關(guān)節(jié)損傷后滑液和原發(fā)性O(shè)A中CP-II含量增加（Lohmander等。1996年）
和OA血清減少（Nelson等人。。單獨(dú)使用或與其他膠原蛋白一起使用時(shí)
降解生物標(biāo)志物，可用于鑒別放射學(xué)前和已建立的膝關(guān)節(jié)OA與no
OA（Cibere等人。2009），OA進(jìn)展（Cahue等人。以及識(shí)別hip OA的子集（Conrozier
等。2007年；2008年）。血清RA中的CPII升高（Nelson等人。1998年；Mansson等人。1995年）并且可以使用
用膠原降解標(biāo)志物檢測(cè)早期（1個(gè)月）對(duì)放射治療的反應(yīng)
1歲時(shí)進(jìn)展（Mullan等人。2007年）。

2。協(xié)議
使用前，將CP-II ELISA試劑盒置于室溫（20-25°C）至少30分鐘。在協(xié)議的所有步驟中都要戴手套。
注1：打開(kāi)前輕輕離心微管，以確保試劑的正確回收。
注2：試劑和樣品在使用前必須輕輕旋轉(zhuǎn)。
根據(jù)表1制定標(biāo)準(zhǔn)。注：CP II與玻璃結(jié)合；在聚丙烯管中構(gòu)成CP II標(biāo)準(zhǔn)。
在聚丙烯混合板上加入50μl的CPⅡ標(biāo)準(zhǔn)和樣品。血清樣品應(yīng)使用緩沖液III稀釋1/2?？芍苯釉谄桨迳舷♂專?5微升血清+25微升緩沖液III）。
將50μL的CPⅡ抗體稀釋至緩沖液中，加入聚丙烯共混板的所有威爾斯中。（一個(gè)平板：50微升CP II抗體+6毫升檢測(cè)緩沖液）。
在室溫下（20-25℃），在700±10轉(zhuǎn)/分鐘的高速微孔板振動(dòng)篩上預(yù)涂聚丙烯共混板，時(shí)間為60分鐘（2分鐘）。
從箔袋中取出CP II酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)板。使用多通道吸管將聚丙烯混合板的每個(gè)孔中的抗原抗體混合物的80μL轉(zhuǎn)移到ELISA板的相應(yīng)威爾斯。
在室溫（20-25°C）下，將覆蓋的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)板在700±10轉(zhuǎn)/分的高速微孔板振動(dòng)篩上培養(yǎng)2小時(shí)（±2分鐘）。
用350微升/稀釋好的洗滌緩沖液（1倍）洗滌酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定板6次，無(wú)浸泡時(shí)間。后一次清洗后，用吸水紙吸干盤子。
添加100微升/孔在緩沖液III中稀釋的GAR-HRP共軛物。
（一個(gè)平板：50微升GAR-HRP/11毫升緩沖液III）。
在室溫（20-25°C）下，以700±10轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速將覆蓋的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)板在高速微板振動(dòng)篩上培養(yǎng)30分鐘（±2分鐘）。
用350微升/稀釋好的洗滌緩沖液（1倍）洗滌酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定板6次，無(wú)浸泡時(shí)間。后一次清洗后，用吸水紙吸干盤子。
添加100微升/井TMB。
在室溫（20-25°C）下，以700±10轉(zhuǎn)/分的速度將覆蓋的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)板在高速微板振動(dòng)篩上培養(yǎng)30分鐘。加入100微升/孔的
停止解決方案。
讀取450 nm處的平板吸光度，宜在10分鐘內(nèi)將參考波長(zhǎng)設(shè)置為630 nm。

3、設(shè)備和材料
所需材料-未提供
去離子水
用于制備洗滌液的量筒
精密移液管，提供20–1000微升的一次性針頭
精密多通道吸管，提供100微升的一次性針頭
渦流混合器
軌道式微型平板振動(dòng)篩，每分鐘轉(zhuǎn)速700轉(zhuǎn)（轉(zhuǎn)/分）
自動(dòng)微孔板清洗機(jī)
雙波長(zhǎng)讀數(shù)450 nm和630 nm的微量滴定板閱讀器（參考濾光片：590-650 nm）
能夠計(jì)算適合數(shù)據(jù)分析的4或5參數(shù)曲線的軟件。供應(yīng)的材料（除非標(biāo)簽上另有說(shuō)明，否則所有試劑應(yīng)在2-8°C下儲(chǔ)存，直至到期日。）
·CP II酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)板。在含有牛血清白蛋白的穩(wěn)定基質(zhì)中包被純化牛CP-II的ELISA板。用帶干燥劑的小袋包裝。
聚丙烯共混板。
牛CP II標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備（10微克/毫升）。從緩沖液III中提取7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品：0、50、100、250、500、1000和2000 ng/mL）。CP II抗體。在含有BSA和非汞防腐劑的蛋白質(zhì)緩沖液中稀釋的兔抗CP-II原代多克隆抗體。
分析緩沖液。含有牛血清白蛋白、山羊正常血清和無(wú)汞防腐劑的蛋白質(zhì)緩沖液。用于稀釋原始抗體。
緩沖液III.含有BSA和非汞防腐劑的蛋白質(zhì)緩沖液。用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和二級(jí)抗體。
GAR-HRP共軛物。含有牛血清白蛋白和非汞防腐劑的蛋白質(zhì)緩沖液中的二級(jí)抗體。
清洗緩沖液（25倍）。含有帶非離子洗滌劑的緩沖鹽水。根據(jù)需要在去離子水中稀釋制備洗滌緩沖液。例如，對(duì)于1000毫升洗滌緩沖液，取40毫升濃縮洗滌緩沖液（25倍），用去離子水補(bǔ)充至1000毫升。洗滌液不含防腐劑。稀釋后在2-8°C下保存不超過(guò)一周。
·TMB。在緩沖液中使用的四甲基聯(lián)苯胺（TMB）溶液。。
停止解決方案。準(zhǔn)備使用0.2 M硫酸。 

程序說(shuō)明
為了獲得可靠的結(jié)果，必須遵循以下建議：
收集樣本，在-70°C下冷凍，如果適用，同時(shí)運(yùn)行所有時(shí)間點(diǎn)（詳情請(qǐng)參閱第5節(jié)）。
在同一個(gè)盤子上分析同一個(gè)人的所有時(shí)間點(diǎn)，并盡可能多地對(duì)樣本進(jìn)行分組。
在整個(gè)研究中使用相同的試劑盒批號(hào)。
·應(yīng)按比例比較一個(gè)人的時(shí)間點(diǎn)結(jié)果，以便評(píng)估隨時(shí)間變化的趨勢(shì)。
·通過(guò)分析一式三份的測(cè)試樣品，將獲得宜結(jié)果。
如果必須重新測(cè)試樣本，則使用相關(guān)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行重新測(cè)試，即如果一個(gè)時(shí)間點(diǎn)是意外的，則重新測(cè)試該時(shí)間點(diǎn)以及同一個(gè)人的至少一個(gè)或兩個(gè)額外的時(shí)間點(diǎn)。
我們建議離心微管以大限度地回收試劑。試劑過(guò)量，以確保所需的容量可以恢復(fù)。
所有試劑和樣品在使用前必須輕輕旋轉(zhuǎn)。
使用前應(yīng)立即稀釋儲(chǔ)備試劑?？贵w和結(jié)合物的終稀釋不穩(wěn)定超過(guò)一天。標(biāo)準(zhǔn)品的終稀釋在2-8°C下穩(wěn)定1周。
每塊板上必須包括一套標(biāo)準(zhǔn)（一式兩份）。
提供緩沖液III，以制定血清和血漿樣品的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)。
對(duì)于其他樣品，應(yīng)使用等效矩陣來(lái)構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)。例如，對(duì)于組織培養(yǎng)，可以使用上清液培養(yǎng)基。
理想情況下，應(yīng)將樣品分為三份進(jìn)行分析。所有要比較的樣品必須經(jīng)過(guò)相同的處理。
避免試劑的微生物污染，特別是儲(chǔ)備抗體和共軛物。
GAR-HRP對(duì)微生物污染、sodium azide、次氯酸和實(shí)驗(yàn)室供水中常見(jiàn)的芳烴高度敏感。
TMB對(duì)光高度敏感，不應(yīng)暴露在玻璃或金屬等硅基材料中。

五、標(biāo)本收藏庫(kù)
采集血液時(shí)不應(yīng)使用抗凝劑，并應(yīng)避免溶血。理想情況下，應(yīng)校準(zhǔn)血清樣本，立即冷凍，并在以下離心（600 g/3000 rpm，10分鐘）下儲(chǔ)存，以去除顆粒物質(zhì)和任何凝塊。我不確定我是否能做到。應(yīng)避免重復(fù)凍融循環(huán)。

六、結(jié)果
用Logistic方程（4或5參數(shù)）繪制X軸上標(biāo)準(zhǔn)軸上的標(biāo)準(zhǔn)吸光度讀數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)X射線濃度。注意，標(biāo)準(zhǔn)曲線是乙狀結(jié)腸的，不是線性的。理想情況下，應(yīng)使用適當(dāng)?shù)那€擬合軟件。
高于高標(biāo)準(zhǔn)的任何樣品讀數(shù)應(yīng)使用緩沖液III稀釋并重新分析。
任何低于低標(biāo)準(zhǔn)的樣品讀數(shù)應(yīng)重新分析或丟棄。

7號(hào)。具體性能特征
7.1交叉反應(yīng)性和特異性
II型膠原（CP II）的C-丙肽由三條相同的35kDa鏈組成，鏈間二硫鍵共價(jià)鍵合。在軟骨基質(zhì)中形成纖維時(shí)，CP-II非螺旋結(jié)構(gòu)域與II型前膠原分子分離。用純化的CP-II蛋白印跡和細(xì)菌膠原酶消化的重組II型膠原證實(shí)了多克隆抗體對(duì)CP-II的特異性。在S35標(biāo)記的CP-II的western blots/autoradiography中，抗體識(shí)別CP-II和至少一種自然降解產(chǎn)物，其氨基末端缺少10 aa。
歷*，該檢測(cè)具有廣泛的交叉反應(yīng)性，可識(shí)別人、猴、馬、牛、狗、大鼠、小鼠和豚鼠CP-II。然而，新的抗體還沒(méi)有用這些或任何其他物種進(jìn)行測(cè)試。我們強(qiáng)烈建議在您的條件下測(cè)試工具包的性能。
本法適用于血清。它也被IBEX客戶用于滑液、血漿、培養(yǎng)基和鹽酸胍提取軟骨。
這種ELISA利用兔抗體。對(duì)含有高濃度兔抗體（如兔血清）的樣品進(jìn)行檢測(cè)會(huì)導(dǎo)致高背景干擾。
終端用戶應(yīng)自行對(duì)這些樣品和任何其他樣品進(jìn)行驗(yàn)證。